甾体激素药物是仅次于抗生素的第二大类药物，2021年，各人商场鸿沟超10亿好意思元的甾体类药物就有5种(https://njardarson.lab.arizona.edu/content/top-pharmaceuticals-poster)。现时甾体工业的开动原料正在由从黄姜等植物中索求的薯蓣皂素搭救为油脂工业的下脚料植物甾醇。自20世纪40年代发现存微生物不错降解植物甾醇以来，已有多种微生物报谈不错降解植物甾醇得到雄烯二酮(androstenedione， AD) 等化合物，如：分枝杆菌(Mycobacterium sp.)[1-2]、红球菌(Rhodococcus sp.)[3-4]、诺卡氏菌(Norcardia sp.)[5]和假单胞菌(Pseudomonas sp.)[6-7]等。在20世纪60–90年代，科研东谈主员通过传统诱变筛选技巧和添加防止剂防止关节酶活力等法子，开发了一系列制备AD、雄二烯二酮(androstadiendione， ADD)、9α-羟基-雄烯二酮(9α-hydroxy-androstenedione， 9α-OH-AD)[8]和谷内酯(sitolactone， HIL)[9]的菌株及转动工艺，这些化合物是合成甾体药物的关节中间体，各人年需求量约3 000 t。但由于甾体代谢门道复杂，中间代谢产物和副产物繁密(图 1)，且甾体化合物性质附进，难以分歧纯化，导致AD、ADD等进击甾体药物中枢原料价钱不菲巨乳 探花，使得我国甾体药物关节原料一直依赖黄姜栽培、从薯蓣皂素合成甾体药物原料药的格式莫得被冲突。植物甾醇替代薯蓣皂素当作甾体药物关节中间体的来源是有用责罚黄姜栽培、索求薯蓣皂素及后期化学加工坐褥过程中占用耕地、“三废”排放量大、环境耻辱严重等问题的有用战略和妙技[10]。通过基因工程、合成生物学技巧法子对野生菌进行校正，从而取得高转动率、高产物纯度的新菌株，及转动过程优化等成为科学界和甾体药物行业的照管热门[8]。

植物甾醇当作食用油工业的副产物，具有来源闲居、价钱便宜等优点。21世纪以来，跟着甾醇代谢门道及关系基因簇的贯通，代谢工程和合成生物学等法子应用于甾体药物关节中间体坐褥菌株构建，新一代基因工程坐褥菌渐渐应用于甾体药物关节中间体的坐褥。

在AD菌株构建方面，José L. García等在耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis) 中敲除9-羟化酶的B亚基(kshB) 和1， 2-脱氢酶(kstD) 基因，构建了基因工程菌，当底物浓度为10 g/L时，88%–90%的底物甾醇转动为产物AD，但同期有10%–11%的底物转动为副产物22-羟基-23， 24-二降胆-4-烯-3-酮(22-hydroxy-23， 24-bisnorchol-4-ene-3-one， BA)[12-14]。在ADD菌株构建方面，相通是José L. García等在M. smegmatis中敲除kshB后，当底物浓度为20 g/L时，55%–70%的底物甾醇转动为产物ADD，有22%–30%转动为副产物AD，同期还检测到其他副产物[12]。在9α-OH-AD菌株构建方面，华东理工大学魏东芝证实注解团队通过敲除新金黄分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum) ATCC 25795的1， 2-脱氢酶，增强抒发9-羟化酶，构建的工程菌在底物浓度15 g/L时，9α-OH-AD达到7.3 g/L，同期含有0.3 g/L的AD，摩尔产率达到67%[15]。在BA菌株构建方面，相通是魏东芝证实注解团队通过敲除团结株M. neoaurum的β-OH-乙酰辅酶A脱氢酶(hsd4A) 基因构建了产BA的菌株，底物浓度40 g/L时，BA的摩尔转动率达47%–49%，但同期有少许AD、22-羟基-23， 24-二降胆-1， 4-二烯-3-酮(22-hydroxy-23， 24-bisnorchol-1， 4-dien-3-one， DBA) 等副产物[16]。积聚HIL的菌株一直是通过诱变及筛选取得的，Nakamatsu等旁边珊瑚色诺卡氏菌(Nocardia coralline IFO 3338) 突变株进行谷内酯坐褥，但摩尔产率只须25%[17-18]。Ferreira等旁边澳大利亚红球菌(Rhodococcus australis CSIR-236.457) 突变株制备谷内酯时，摩尔产率可达60%，当底物浓度在6–12 g/L时，摩尔产率约为63%，但底物浓度升高至15 g/L时，摩尔产率降为48%–57%[9]。

中国科学院天津工业生物技巧照管所前期筛选到了一株可产BA和DBA的分枝杆菌(Mycobacterium sp.) CGMCC NO.13234[19-20]，在此基础上对基因组进行测序并重构甾醇代谢门道，除也曾报谈的kshAB、kstD和hsd4A外，延续发现17β-羟基甾体脱氢酶基因(17β-hsd)、羟醛裂解酶基因(halT和ltp2)、羧酸规复酶基因(car1和car2) 影响AD、ADD、9α-OH-AD和HIL的纯度和产量[21]。此外，增强抒发3β-甾体脱氢酶基因(3β-hsd) 可加快甾醇的代谢，由此构建了具有自主学问产权的坐褥甾体药物中枢原料(AD、ADD、9α-OH-AD、HIL和BA) 的菌种，并于2021年9月通过浙江省科技厅组织的技巧漂荡。

在植物甾醇的降解、转动过程的一系列关节酶王人是胞内酶，植物甾醇需要穿过细胞膜材干参预胞内。但是在老例的水相发酵体系中，植物甾醇的融化度仅为0.1–1.0 mmol/L，导致菌体对底物的摄入严重不及，这亦然严重制约植物甾醇转动为甾体药物关节中间体技巧应用的因素之一。

科研东谈主员在提高膜通透性及通过反馈体系提高底物融化度方面开展了照管责任，在一定进度上提高了菌株转动植物甾醇的服从。烦躁强等在使用分枝杆菌代谢植物甾醇合成9α-OH-AD的反馈中，使用大豆油(添加浓度为25%–30%) 和葵花籽油等，增大了底物的漫步性更利于底物的转动[22]。Smith等旁边Mycobacterium sp.代谢胆固醇，在培养体系中添加2%的Tween-80与胆固醇浑浊液，使达到相通终端的代谢时期裁减2–3 d[23]。Korycka-Machala等的照管标明聚阳离子(举例鱼精卵白) 能增多不溶于水性物资对分枝杆菌细胞膜的渗入，当发酵液中添加鱼精卵白时，β-谷甾醇的代谢速度提高了3倍[24]。周龙飞等将非离子名义活性剂壬基酚乙氧乙烯醚(TX-40) 用于Mycobacterium sp. LY-1转动植物甾醇坐褥9α-OH-AD，使9α-OH-AD的摩尔得率较添加18%大豆油时提高了11.0%[25]。许桠楠等熟习不同助溶剂与TX-40复配对菌株转动植物甾醇的影响，并通过正交实际的法子详情最适的复配比例。进而尝试添加分枝杆菌细胞膜的防止剂，开发故意于分枝杆菌转动植物甾醇的两相转动体系，进一步提高分枝杆菌转动植物甾醇生成标的产物的智商[26]。

大鸿沟工业化坐褥大多以植物油来提高植物甾醇的漫步性，从而提高投料浓度和坐褥强度。该工艺浅易、褂讪、可操作性强，但也存在有机溶剂使用量大、分歧纯化工艺复杂、难以终了自动化和链接化等不及。链接自己菌种性格，中国科学院天津工业生物技巧照管所与浙江仙居君业药业有限公司的科研东谈主员一谈开发了植物甾醇微油转动坐褥工艺，大幅拔擢了植物甾醇的底物投料浓度，并以此为基础开发了链接坐褥工艺，摩尔产率达75%–90%，发酵萃取液产物纯度不低于92%，坐褥强度可达200–300 g/(m3·h)，大幅提高了菌株的时空转动率和坐褥强度。

在2012年之前，浙江仙居君业药业有限公司受困于技巧方面的因素，公司坐褥甾体药物的基础中枢母核原料是外购的双烯。双烯以栽培的黄姜为肇始原料，经强酸明白索求薯蓣皂素后，通过化学裂解的方式制取，坐褥过程中产生迢遥的强酸废水，处理资本很高。跟着国度环保条款的日益提高，酿成了双烯原料供应不及，价钱飞涨，诬捏了公司的商场竞争力。

浙江仙居君业药业有限公司与中国科学院天津工业生物技巧照管所互助，提前布局，组建甾体生物转动集合实际室，开展生物合成技巧转动植物甾醇坐褥AD等甾体药物基础母核原料的研发攻关责任，突破了AD等菌种构建和生物转动工艺，取得零丁学问产权菌种。在此技巧基础上，交融自动化、数字化、信息化技巧，顺利建成了国内草创、海外跨越的甾体药物中枢原料柔性智能坐褥线，终显然甾体母核到原料药(去氢表雄酮，DHEA) 全产业链的高效生物催化坐褥安装，突破了甾体药物制造过程中的高耗能、高耻辱瓶颈，建成了一座年产千吨级的甾体中枢原料药关节中间体的绿色生物制造的智能工场(图 2)。

“甾体药物中枢原料的数字智能化绿色生物制造”方式是所企两边阐扬各自上风十年通力互助的结晶。该方式于2019年列入国度发改委和工信部技巧校正方式，2020年被认定为浙江省甾体药物智能工场。现在，该方式已投资2.6亿元，其中智能化设备投资达2亿元，终显然AD、9α-OH-AD、BA等五大关节甾体药物中间体的发酵车间、索求车间、能源车间和罐区、环保站的全程自动化、绿色化，形成了年产1 000 t中枢原料的坐褥智商，新增产值10亿元。这亦然国内唯独一家甾体药物中枢原料的自动化坐褥工场。

君业药业攻克医药产业数字化转型的宝贵，依托工业APP、工业互联网平台和数据源，从价值链、业务链、数据链3个维度打造年产千吨级的甾体药物“智能工场”，大步迈向“新智造”、迈向“翌日工场”。在工业互联网平台中设置坐褥原料供应模块、工艺监控模块、能耗监控模块等9大模块，终了从原料采购、入库到过程使用、产出、质地情况的全过程数据知道，以“透明工场”优化企业日常运营和经管。攻克了复杂分子药物原料生物法合成的中枢关节技巧，草创数字智能化链接发酵、链接索求的自动化工艺，责罚了高浓度链接投料、细胞活性褂讪、产物防止即时废除等宝贵，终了参数调控、物料更正、设备清洗等各项操作的“一键式”良友截止，权贵提高了坐褥服从和坐褥集约化水平，提高坐褥服从，诬捏东谈主工资本。对每台设备进行精致化经管，通过大数据分析进行预防性维保，大幅诬捏设备故障停机频率，减少悭吝资本，提高设备悭吝东谈主职责任服从。同期，对能耗资本张开精致化经管，制定水、电、汽全维度用能统计分析报表，通过数据分析优化坐褥过程截止、热量回收等活动，不停优化企业用能经管，终了低碳坐褥。

本方式为医药化工绿色转型升级作念出了示范。台州地区山净水秀，但医药化工产业齐集。本方式建成了国内首个药物发酵、索求、精制全过程自动化、链接化坐褥的智能工场，开始终了甾体药物中间体的清洁坐褥。与行业现行工艺比拟，本方式终显然“一高五低”：即坐褥服从提高50%、蒸发性有机化合物(volatile organic compounds， VOC) 排放减少70%、废水排放减少30%、发酵菌渣诬捏40%、能耗减少40%、东谈主工诬捏70%。本方式为医药化工通过生物制造终了绿色化坐褥作念出了示范，是生物技巧-信息技巧(biotechnology-information technology， BT-IT) 链接的经典案例。

本方式责罚了区域甾体医药产业发展原料供应瓶颈问题。台州地区当作国度科技部批准的唯独的甾体类药物产业基地，各样甾体药物坐褥企业数十家，甾体激素原料药产能约占各人30%的份额以上。现在甾体药物肇始原料供应问题严重制约了台州地区甾体医药行业各家企业的产品竞争力，君业药业有限公司千吨级中枢甾体药物肇始原料方式的投产，透顶责罚了台州地区甾体药物坐褥企业的原料供应的瓶颈问题，将大大拔擢区域企业的产品竞争力，促进台州地区甾体药物坐褥基地作念大作念强。

本方式提高了国度甾体药物产业安全性。当作国内唯独一产物有完好学问产权的甾体药物肇始原料坐褥线，终显然甾体药物5大关节原料中间体的全隐敝、共坐褥线、高质地坐褥，坐褥工艺、环境保护、产品性量等打算均达到寰宇一活水平，能倨傲国内甾体药物肇始原料50%的商场需求，有劲地保险了我国甾体药物供应链的褂讪与安全。

我国甾体药物关节中间体坐褥方式正在快速由以黄姜等植物索求校正薯蓣皂素结构的化学法搭救为生物转动植物甾醇(油脂工业副产物) 制造法，慢慢终显然开动原料的替代。在这一技巧替代的过程中，中国科学院天津工业生物技巧照管所针对国度、商场和企业的本色需求，开发了系列甾体药物中间体转动菌株，有用保证了我国甾体药物原料供应的安全，也助力企业提高了商场竞争力及发展壮大。

咱们将旁边调控元件对传统甾体药物中间体坐褥菌株延续优化，提高摩尔产率和时空产率，有用诬捏坐褥资本，使企业的智能化坐褥工场阐扬出最大作用。咱们也将与有机合成等鸿沟的各人密切配合，基于进击甾体药物分子的逆合要素析，旁边合成生物学关节催化元件，构建更适于甾体原料药合成的新一代中间体生物转动菌株，诬捏化学合成难度，开发更绿色环保的新合成工艺。同期，咱们也将与企业潜入互助，将数字信息技巧应用于生物发酵转动过程，提高菌株的鲁棒性，使坐褥菌永劫期保握高活力情景，大幅诬捏坐褥资本，终了最猛进度的“节能减排”。合成生物学的发展，有可能终了从葡萄糖等浅易原猜想甾体关节中间体乃至甾体原料药的径直生物合成，透顶颠覆甾体药物的坐褥范式。

“路漫漫其修远兮巨乳 探花，吾将高下而求索”。在甾体药物关节中间体的生物制造方面，咱们将奋笔疾书属于这个期间的华彩篇章。